طريقة تركيب الطور الصلب لميلانوتان I

خلفية

Melanotan I، المعروف أيضًا باسم Afamelanotide، هو عبارة عن بولي ببتيد خطي يتكون من 13 حمضًا أمينيًا يستعد للعب دور متزايد الأهمية في الأبحاث الصيدلانية. الأسماء الإنجليزية الأساسية لـ Melanotan I هي Melanotan-1 وAfamelanotide. باعتباره نظيرًا اصطناعيًا للهرمون المحفز للخلايا الصباغية α-MSH)، يمكن استخدام الميلانوتان I لعلاج اضطرابات الحساسية للضوء الناجمة عن البروتوبرفيريا المكونة للكريات الحمر. في الوقت الحالي، تم تصنيف معظم منتجات Melanotan I للاستخدام البحثي فقط ولم يتم تصميمها بعد للاستخدام البشري. في تصنيع الطور الصلب التقليدي، يؤثر اختيار الراتينج بشكل كبير على كفاءة الاقتران والنقاء النهائي للمنتج.

المعلومات الأساسية

الاسم الصيني: ميلانوتان 1
الاسم الانكليزي: ميلانوتان-1
رقم الشركة: GT-A006
رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 75921-69-6
التسلسل: SYS {Ne} EH {D-Phe} RWGKPV-NH2
الصيغة الجزيئية: C78H111N21O19
الوزن الجزيئي: 1646.88

 طريقة التحضير

أنا. تحضير راتنج Fmoc-Val-Amino

الخطوة 1:قم بوزن 11.11 جم (5 ملمول) من راتينج Ramage Amide AM بدرجة استبدال تبلغ 0.45 ملمول/جم وقم بإضافته إلى مفاعل الطور الصلب. أضف DCM لتنتفخ الراتينج لمدة 30 دقيقة، ثم صفيه. يغسل ثلاث مرات مع DMF. إضافة حل DMF يحتوي على 20% بيبيريدين (v/v) والرد لمدة 5 دقائق. أضف محلول DMF بيبيريدين 20% آخر وتفاعل لمدة 10 دقائق، مع غسل DMF واحد بينهما. بعد اكتمال رد الفعل، استنزاف وغسل ثلاث مرات مع DMF.

الخطوة 2:حل 5.09 جرام من Fmoc-Val-OH، و2.02 جرام من HOBT (1-هيدروكسي بنزوتريازول)، و2.32 مل من مدينة دبي للإنترنت (N، N'-diisopropylcarbodiimide) في DMF عند 0 درجة مئوية. بعد الذوبان الكامل، يضاف الخليط إلى عمود التفاعل ويتفاعل عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. مراقبة تقدم التفاعل باستخدام اختبار النينهيدرين، وضمان نتيجة سلبية. بعد اكتمال رد الفعل، يغسل ثلاث مرات مع DMF للحصول على راتنج Fmoc-Val-amino.

ثانيا. تحضير الببتيد الراتنجي المحمي بالكامل من الميلانوتان I.

الخطوة 1:إضافة بيبيريدين 20% في حل DMF (نسبة الحجم) إلى معتدلاً-فال-أمينوريسين أعلاه. يتفاعل لمدة 5 دقائق، ثم يضاف جزء آخر من 20% بيبيريدين في محلول DMF ويتفاعل لمدة 10 دقائق. يغسل مرة واحدة مع DMF خلال الفترة الفاصلة. بعد اكتمال التفاعل، جفف تحت الفراغ واغسل ثلاث مرات باستخدام DMF.

الخطوة 2:حل 5.06 جرام Fmoc-Pro-OH، 2.02 جرام HOBT (1-هيدروكسي بنزوتريازول)، و2.32 مل مدينة دبي للإنترنت (N، N'-diisopropylcarbodiimide) في DMF عند 0 درجة مئوية. بعد الذوبان الكامل، يضاف الخليط إلى عمود التفاعل ويتفاعل عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. راقب تقدم التفاعل باستخدام اختبار النينهيدرين (اختبار كايزر) حتى يتم الحصول على نتائج سلبية. عند الانتهاء، يغسل ثلاث مرات مع DMF للحصول على Fmoc-Pro-Val-aminoresin.

الخطوة 3:باتباع الطريقة الموضحة في الخطوة 2، قم بربط كل حمض أميني بشكل تسلسلي وفقًا لتسلسل الميلانوتان الأول. بعد الانتهاء من تفاعل اقتران Ac-Ser(tBu)-OH، اغسل ثلاث مرات مع DMF، ثلاث مرات مع DCM (ثنائي كلورو ميثان)، وثلاث مرات مع الميثانول. يجفف تحت فراغ للحصول على 23.89 جم من الببتيد الميلانوتان I المرتبط بالراتنج المحمي بالكامل.

ثالثا. تحضير ميلانوتان أنا الببتيد الخام
تم وضع 23.89 جم من الببتيد الميلانوتان الأول المحمي بالكامل والمرتبط بالراتنج في قارورة مستديرة القاع. عند 0 درجة مئوية، تمت إضافة 250 مل من كوكتيل الانقسام المُعد مسبقًا (المكون من TFA: thioanisole:phenol: triisopropylsilane:water = 82.5:7.5:5:3:2 من حيث الحجم) ببطء تحت التحريك. تم تفاعل الخليط عند درجة حرارة منخفضة لمدة 0.5 ساعة، يليه التفاعل عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. تم بعد ذلك ترشيح محلول الانقسام تحت الفراغ. تمت إضافة هذا المحلول ببطء إلى 2 لتر من ثنائي إيثيل إيثر اللامائي البارد تحت التحريك. تم عزل الببتيد الخام عن طريق الترشيح، وغسله ثلاث مرات باستخدام ثنائي إيثيل الأثير المثلج، وتم الحصول على 8.55 جم من الببتيد الخام Melanotan I.

رابعا. تحضير الميلانوتان I الببتيد المنقى
الخطوة 1:قم بإذابة الببتيد Melanotan I الخام في 100 مل من الماء النقي وقم بالتصفية من خلال غشاء 0.45 ميكرومتر للحصول على محلول الببتيد الخام.

الخطوة 2:تنقية الميلانوتان الخام أنا الببتيد باستخدام اللوني السائل عالي الأداء (HPLC). الاستفادة من عمود الضغط المحوري الديناميكي DAC-HB50 مع المرحلة المتنقلة A (0.05% محلول مائي من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك) والمرحلة المتنقلة B (حمض ثلاثي فلورو أسيتيك في الأسيتونيتريل). أداء شطف التدرج للفصل والتنقية. كشف العينة باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية وجمع محلول الببتيد المطابق للذروة المستهدفة في الكسور.

الخطوة 3:بعد تنقية HPLC، احصل على 180 مل من محلول Melanotan I trifluoroacetate بنقاء يتجاوز 99٪. تركيز المحلول إلى 50 مل عن طريق التبخر الدوار.

الخطوة 4:موازنة العمود اللوني مع الماء منزوع الأيونات وتحميل 50 مل من محلول Melanotan I trifluoroacetate المنقى (نقاء> 99٪). أزل لمدة 50 دقيقة في نظام محلول مائي حمض الخليك 2٪. تركيز المنتج المستهدف الذي تم جمعه إلى 80 مل عن طريق التبخر الدوار. إجراء تجفيف ما قبل التجميد والتجفيف بالتجميد للحصول في النهاية على 5.33 جرام من الميلانوتان I الببتيد المنقى، مع عائد قدره 32.33%.